限制性內切酶在不同緩沖液中的活性         

NEB 目前提供超過 200 種 CutSmart 內切酶，這些內切酶在 CutSmart 緩沖液中活性為 100%。這大大提高了內切酶的效率、靈活性和簡便性，尤其是進行雙酶切時。

該表總結了 NEB 所有限制性內切酶的活性信息。為了幫助您選擇雙酶切的最佳條件，該表列出了酶的最佳活性 NEBuffer（隨酶提供）和每種內切酶在四個標準緩沖液中的活性。需要注意的是 BSA 現在已經添加到緩沖液中，不再單獨提供。雙酶切反應體系請參考 2013﹒2014 商品目錄第 276 頁。此外，活性表中列出了反應溫度、熱失活溫度、推薦稀釋液、甲基化敏感性和該酶是否有省時酶特性（即在建議的反應條件下，5-15 分鐘可完全切割底物，過夜酶切也不會降解 DNA）。

注：表中數值為近似值，所用底物與內切酶定義中的底物相同，更新的內容請查閱 www.neb-china.com 及
        www.neb.com。

反應溫度：

表中列出了限制性內切酶的最適反應溫度。對于最適反應溫度不是 37℃ 的限制性內切酶，請閱 2013﹒2014 商品目錄 284 頁查詢其在 37℃ 時的活性。

熱失活：

熱失活是終止酶切反應的一種簡便易行的方法。大多數最適反應溫度為 37℃ 的酶，在 65℃ 條件下溫育 20 分鐘即可失活。一些在 65℃ 下不能失活的酶如將溫度升高至 80℃，溫育 20 分鐘也可失活。下表注明了該酶能否進行熱失活以及熱失活的相應溫度。

稀釋緩沖液：

稀釋限制性內切酶時，建議使用稀釋緩沖液（A、B 或C）。建議用前稀釋且稀釋終濃度不要低于 1,000 units/ml。目錄及說明書中標注了每一種內切酶相應的稀釋緩沖液。

稀釋緩沖液成份：

稀釋液 A：

50 mM KCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀釋液 B：

300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，500 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀釋液 C：

250 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.15% Triton X-100，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

活性注意事項：

1. 延時酶切、高酶濃度或者甘油濃度超過 5% 會導致星號活性。

2. 延長酶切時間會導致星號活性。

3. 甘油濃度超過 5% 會導致星號活性。

*在該緩沖液中可能會出現星號活性。

活性圖

DNA 修飾酶在 CutSmart 反應緩沖液中的活性           

在常用的克隆酶中，選出了一系列 DNA 修飾酶，用 CutSmart 緩沖液代替隨酶提供的緩沖液，進行酶活檢測。比較酶在 CutSmart 緩沖液（添加必須的輔助因子）和隨酶提供的緩沖液中的活性。反應體系是根據修飾酶的推薦反應體系建立的，用 CutSmart 反應緩沖液替代隨酶提供的反應緩沖液。結果比較如下表中所示。

+ + + 具完全功能活性           + + 具 50-100% 功能活性                         + 具 0-50% 功能活性

星號活性（特異性降低或改變）                

在非理想的條件下，內切酶切割與識別位點相似但不完全相同的序列，這一現象稱星號活性。有人提出，這種“星號”活性可能是內切酶的一種普遍特性（1），如果提供給相應反應條件，所有內切酶都會出現非特異性切割。雖然星號活性產生的傾向性不同，但是當使用隨酶提供的NEBuffer 時，內切酶不會產生星號活性。如果已經報道該酶存在星號活性，那么在產品目錄、說明書和網站上會做說明。

酶識別特異性的改變受酶本身的性質及可能引起星號活性的反應條件影響。常見的引起酶識別改變的條件有：單堿基替換、識別序列外側堿基縮短以及單鏈切刻（2）。有些酶顯示在標準反應條件下序列特異性降低，并且有同源位點時，能夠切開非同源（次級）位點（3）。

注：上述反應條件的改變對于每種酶的影響不同。

NEB 建議使用 50 μl 反應體系進行酶切。但在必須使用小體積酶切時，需要注意以上列舉的各種情況以避免星號活性。
此外，可使用 NEB 的系列產品高保真內切酶（HF）可以使操作更簡便。更多高保真內切酶信息請查詢 NEB 的網站。

降低星號活性的 HF 內切酶                

下表為 HF 內切酶和其野生型在檢測到明顯星號活性前的最大酶用量。HF 指數代表在選擇 HF 內切酶時酶用量增加的倍數，數據清楚顯示了 HF 內切酶帶來的靈活性。
 

高保真限制性內切酶            

NEB 一直致力于限制性內切酶的研究和改進，現向您提供最新系列的高保真限制性（HF）內切酶。這些酶與其野生型有相同的特性，在 CutSmart 反應緩沖液中都有活性，但經基因工程改造后降低了星號活性。星號活性或特異性降低是限制性內切酶的天然特性。大多數酶在推薦條件下反應是不會導致星號活性，然而，對于已報道有星號活性的內切酶，為避免非特異性切割，一定要按照推薦的反應條件建立反應體系。

很多技術需要在非最佳條件下使用內切酶，如：克隆、基因分型、突變檢測、基因定位、探針制備、測序和甲基化檢測等。HF 內切酶降低了星號活性，給酶切反應提供更多選擇并能在更多情況下獲得最好的切割效果。

除了降低星號活性外，所有的 HF 內切酶都能在兼容性最強的 CutSmart 反應緩沖液中達到最佳切割效果，因此簡化雙酶切反應。此外 HF 內切酶全都是省時內切酶，能在 5-15 分鐘內消化底物。HF 內切酶與原酶的價格相同。

關于高保真內切酶更多相關信息，請查詢 NEB 網站 www.neb-china.com 及 www.neb.com/HF。

高保真限制性內切酶常見問題解答

Q.為什么 HF 內切酶推薦使用的緩沖液與野生型的內切酶不同？

A. 在許多情況下，突變導致高保真內切酶的最適緩沖液發生變化。比如，野生型 SalI 酶的最適緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強度緩沖液，然而 SalI-HF^? 的最適緩沖液為中等離子強度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 緩沖液有什么優勢嗎？

A. 是的，超過 200 種限制性內切酶（包括高保真限制性內切酶）在 CutSmart 緩沖液中有活性。當建立雙酶切反應時有很大優勢。 

具有省時酶特性（Time-Saver?）的限制性內切酶                

效率高，5-15 分鐘實現快速酶切；純度高，過夜酶切不降解。 

無論您是在進行大量克隆的快速篩選還是進行過夜酶切，NEB 高品質的酶都會給您帶來更大的便利。通常，進行限制性酶切時都需要在 50 μl 反應總體系中，加入 1 μl 酶反應 1 小時來消化 1 μg 純化的 DNA。但是，若選用 NEB Time-Saver 特性的酶，可以大大加速您的篩選進程。這些酶在建議反應條件下，加入 1 μl 就可以在5-15 分鐘內消化 1 μg DNA。且這些酶在產品規格、濃度上沒有任何改變，也不需要重新購買更貴的新產品來實現 5-15 分鐘快速酶切，這與其他供應商的產品完全不同。溫育時間過長你也不必擔心。

為了向您提供更多信息，NEB 通過單位定義底物 DNA 和質粒 DNA 測試了所有酶的活性。只建議用作參考，不適用于所有的質粒。限制性內切酶通常顯示出的位點優勢效應，是由識別位點側翼序列決定的。此外，超螺旋DNA 的切割速率變化很大，更多信息請參見網站的技術支持部分。注意以下有些內切酶可以在 5-15 分鐘切割底物，但是不能用于過夜酶切，因此不具有 TimeSaver 特性。

由于所有 NEB 的酶都經過核酸酶污染的嚴格檢測，您可以放心的進行長時間酶切而不必擔心樣品降解。只有NEB，可以提供給您如此高的效率和純度，效率高—5-15 分鐘實現快速酶切；純度高—過夜酶切樣品不損失。

省時內切酶的效率和純度：

1 μl SalI 5 分鐘內消化 1 μg DNA，結果顯示長時間酶切或過夜 (O/N) 消化沒有核酸酶污染。
Marker (M) 是 1 kb DNA Ladder (NEB #N3232) 。